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中国人肌营养不良症患者蛋白基因缺失的研究

http://www.51xue.org.cn  2007/6/8 源自:中华职工学习网 【字体: 字体颜色

关键词:肌营养不良;基因;缺失 

  摘要:目的 了解中国人Duchenne和Becker型肌营养不良症患者基因缺失情况。 方法 用覆盖dystrophin cD-NA全长56.3%的5个dystrophin cDNA探针检测41名无亲缘关系的DMD/BMD患者。 结果 22名(54%)患者存在基因突变,其中DMD患者的检出率为56.7%:BMD患者的检出率为45%。21名患者存在基因缺失,占检出数的95.45%。 结论 缺失主要分布在cDNA8检测区,其次在cDNA1-2a检测区。
  
  关键词:肌营养不良;基因;缺失
  
  Study on the gene deletion in patients with Duchenne muscular dystrophy(DMD and Becher muscular dystrophy(BMD).
    Abstract:Objective To investigate the circumstances of gene deletion of Chinese patients with Duchnne’s type muscular dys-trophy(DMD and Becher muscular dystrophy(BMD). Methods Circumstances of gene deletions in41unrelated DMD and BMD patients were studied by using a32-p-dCTP labeled dystrophin cDNA probe(1-2a,4-Sa,Sb-7,8and9)covering56.3%of dystrophin full-length cDND. Results Gene mutation was observed in22patients accounted for56.3%,the DMD detection rate was56.7%and BMD detection rate was45.0%.Gene deletion wasoccurred to21patients accounted for95.45%of the total de-tected. Conclusion The hot point of gene deletion in DMD patients was mainly distributed in the cDNA8region(exon47~52and followed by the cDNA1~2a region(exon1~9).The deletion was not evenly distributed involving different exons and extent.
  
  Key words:Muscular dystrophy;Gene;Deletion
    
  Duchenne和Becker型肌营养不良症(DMD/BMD)是我国最常见的与X染色体连锁的隐性遗传性疾病,发病率约1/3300活男婴 [1] 。该病系肌营养不良蛋白(dystrophin)基因突变所致 [2,8] 。DMD患者在2~3岁出现肌无力,渐发展成不能行走,12岁开始依赖轮椅,20岁左右常因呼吸衰竭死亡;BMD患者临床症状较缓和,大多在15岁以后的某个时期依赖轮椅,但有的直到60岁仍能行走 [1] 。
  1 对象和方法
  
  1.1 研究对象 41名无亲缘关系的DMD/BMD患儿标本随机收集自解放军总医院肌病门诊。其中DMD患者30名,年龄在2~23岁;BMD患者11名,年龄在12~38岁。根据进行性肌萎缩、肌无力,腓肠肌假性肥大,家族史,血清CK值显著增高,肌电图呈肌源性损害,肌活检示肌肉坏死、变性、再生、结缔组织增生等特征确诊患者。取5名正常女性标本作为对照。
  1.2 方法 实验所用dystrophin cDNA探针菌种购自美国ATCC公司。采用碱变性法抽提质粒DNA [3] ,用限制性内切酶EcoR I和/或HindⅢ酶切质粒,电泳分别回收5个探针片段:cDNA 1-2a ,cDNA 4-5a ,cDNA 5b-7 ,cDNA 8 和cDNA 9 。随机引物法将α-32p-dCTP(Amer-sham)标记于cDNA探针上 [4] 。按Smith方法制备白细胞DNA [5] ,用HindⅢ完全酶解后于0.8%的琼脂糖凝胶中电泳36~48h,再经Southern印迹将DNA转移至尼龙膜(Hybond  TM -N+,Amersham)上,固定后置于预杂交液中(0,5M Na-PO 4 pH7.2,7%SDS,0.1%鲑鱼精DNA,lmM EDTA),65℃预杂交3h,加入变性后的探针继续于65℃杂交12h [6] 。-70℃放射自显影3~7d,冲片后分析结果。
  
  2 结果
  
  用覆盖dystrophin全长56.3%的上述5个cDNA探针,从41名病人中检出22例有基因突变,占全部患者的53.66%。其中DMD病人17名,占DMD病人的56.7%(17/30);BMD病人5名,占其患者数的45.4%(5/11)。22例基因突变中,21例为基因缺失,另1例为存在一异常的连接片段,其具体突变类型未被检出。如表1所示。
  3 讨论
  
  3.1 缺失突变 从表1中看到,21例缺失不规则地分布在cDNA检测区。缺失相对集中在两个区域:cD-NA 8 检测区(15例,占71%)和cDNA 1-2a 检测区(5例,占24%)。cDNA 5b-7 和cDNA 9 检出的9例缺失中,有8例缺失区延伸至cDNA 8 检测区。这种缺失区分布特征与国外大综报道一致 [7] 。
  
  缺失所累及的外显子数目不一,或为一个,或达28个。每个外显子受累频度亦不相同,或为1次,或为13次(48号外显子),见表1。外显子受累频率为PCR检测患者提供了参考依据。
  表1 41例DMD/BMD患者的缺失情况(略)
  Tab1 Deletions Of41DMD/BMD Patients
  
  *注:本组患者中共有21例患者存在缺失突变。Note:21cases with deletion mutations.
    
  Dystrophin基因位于Xp21区带,长达2300Kb,是迄今所知最长的一个基因 [8] 。该基因外显子9-60之间有26个同源顺序,它们在姊妹染色体分裂过程中较容易发生染色体内同源顺序重组,造成同源顺序间的DNA丢失 [7] 。由于同源顺序多,分布广泛,同源顺序重组致使DNA断裂点多,缺失位置和范围不定,可以解释DMD/BMD患者dystrophin基因内形式多样的缺失突变。
  3.2 根据整码缺失部位推测dystrophin基因的关键区 移码突变致使外显子缺失及与其相连的外显子遗传密码的变化,影响到dystrophin的半胱氨酸富集区和C末端,从而根据移码突变不易判定dystrophin的关键区段。而通过分析整码缺失则有可能达到此目的。如表2对患者临床表型、起病年龄和整码缺失区域进行对比分析后,我们推测dystrophin基因的关键区之一位于50和51号外显子。从表2中看到,外显子整码缺失较少的12号和19号患者,发病早于缺失数 较多的8号、10号和11号患者。前者1~2岁发病,累及50~51号外显子,后者4~6岁发病,未累及这两个外显子。另2例BMD患者(1和4号患者)外显子整码缺失个数相同,均为3个,分别累及3~5号和47~49号外显子。而后者发病较早(13岁),可能说明47~49号外显子编码的氦基酸序列较重要,这与它们同关键的50~51号外显子相连,并协助50~51号外显子发挥功能有关。
  
  表2 整码缺失突变与临床表现的关系(略)
    
  Tab2 The relation of In-frame deletions and clinical representations
  3.3 其它突变类型 本组尚有19例患者(占46.3%)未被检出dystrophin基因组DNA/HindⅢ片段的异常。用cDNA杂交检测的方法,分辨率在400bp以上,故不可能发现基因内的微小突变及点突变。部分探针(cDNA 2b-3,10-14 )未进行检测,亦遗漏了部分基因突变的检出。据报道,dystrophin基因突变类型尚有重复突变、易位、基因内到位、及影响mRNA后加工的内含子的突变 [9] 。
  参考文献:
  
  [1]l刘焯霖,梁秀龄[M].神经遗传病学.北京:人民卫生出版社出版,1988,125.
  
  [2]Koemg M,Monaco AP,Kunkel LM.The complete sequence of dystrophin predicts a rodshaped cytoskeletal protein[J].Cell,1988,53:219.
  
  [3]Maniatis T,Fritsch EP,Sambrook J(eds).Large-scale isolation of plas-mid DNA[J].Molecular cloning-A laboratory manual6th ed.1982,86.
  [4]Feinberg AP,Vogelstem B.A technique for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity[J].Anal Biochera,1983,132:6.
  
  [5]Smith CL.Purification,specific fragmentation and separation of large DNA molecules.In methods in Enzymology;Recombinat DNA,ed.R Wu Aca-demic Press[J].Nes York,1987,155:449.
  
  [6]Wetmur JG and Davidson N.Kinetics ofrenaturation of DNA[J].J Mol bi-ol,1968,31:349.
  
  [7]Blonden CJ.242breakpoints in the200-Kb deletion-prone P20regm of the DMD gene are wildely spread[J].Genomics,1991,10:631.
  
  [8] Koenig M,Hoffman EP,Bertelson CJ,et al.Complete cloning at the Duchenne muscular dystrophy(DMD)eDNA and preliminary genomie orga-nization of the DMD gene in normal and affected individuals[J].Cell,1987,50:509.
  
  [9]Koemg M,Beggs AH,Moyer M,et al.The molecular basis for Duchenne versus Becket muscular dystrophy correlation of severitywith type of deletion [J].Am J Hum Genet,1989,45:498.

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