关键词：肌营养不良;基因;缺失
摘要:目的 了解中国人Duchenne和Becker型肌营养不良症患者基因缺失情况。 方法 用覆盖dystrophin cD-NA全长56.3%的5个dystrophin cDNA探针检测41名无亲缘关系的DMD/BMD患者。 结果 22名（54%）患者存在基因突变，其中DMD患者的检出率为56.7%:BMD患者的检出率为45%。21名患者存在基因缺失，占检出数的95.45%。 结论 缺失主要分布在cDNA8检测区，其次在cDNA1-2a检测区。
关键词:肌营养不良;基因;缺失
Study on the gene deletion in patients with Duchenne muscular dystrophy（DMD and Becher muscular dystrophy（BMD）.
Abstract:Objective To investigate the circumstances of gene deletion of Chinese patients with Duchnne’s type muscular dys-trophy（DMD and Becher muscular dystrophy（BMD）. Methods Circumstances of gene deletions in41unrelated DMD and BMD patients were studied by using a32-p-dCTP labeled dystrophin cDNA probe（1-2a，4-Sa，Sb-7，8and9）covering56.3%of dystrophin full-length cDND. Results Gene mutation was observed in22patients accounted for56.3%，the DMD detection rate was56.7%and BMD detection rate was45.0%.Gene deletion wasoccurred to21patients accounted for95.45%of the total de-tected. Conclusion The hot point of gene deletion in DMD patients was mainly distributed in the cDNA8region（exon47～52and followed by the cDNA1～2a region（exon1～9）.The deletion was not evenly distributed involving different exons and extent.
Key words:Muscular dystrophy;Gene;Deletion
Duchenne和Becker型肌营养不良症（DMD/BMD）是我国最常见的与X染色体连锁的隐性遗传性疾病，发病率约1/3300活男婴 ［1］ 。该病系肌营养不良蛋白（dystrophin）基因突变所致 ［2，8］ 。DMD患者在2～3岁出现肌无力，渐发展成不能行走，12岁开始依赖轮椅，20岁左右常因呼吸衰竭死亡;BMD患者临床症状较缓和，大多在15岁以后的某个时期依赖轮椅，但有的直到60岁仍能行走 ［1］ 。
1 对象和方法
1.1 研究对象 41名无亲缘关系的DMD/BMD患儿标本随机收集自解放军总医院肌病门诊。其中DMD患者30名，年龄在2～23岁;BMD患者11名，年龄在12～38岁。根据进行性肌萎缩、肌无力，腓肠肌假性肥大，家族史，血清CK值显著增高，肌电图呈肌源性损害，肌活检示肌肉坏死、变性、再生、结缔组织增生等特征确诊患者。取5名正常女性标本作为对照。
1.2 方法 实验所用dystrophin cDNA探针菌种购自美国ATCC公司。采用碱变性法抽提质粒DNA ［3］ ，用限制性内切酶EcoR I和/或HindⅢ酶切质粒，电泳分别回收5个探针片段:cDNA 1-2a ，cDNA 4-5a ，cDNA 5b-7 ，cDNA 8 和cDNA 9 。随机引物法将α-32p-dCTP（Amer-sham）标记于cDNA探针上 ［4］ 。按Smith方法制备白细胞DNA ［5］ ，用HindⅢ完全酶解后于0.8%的琼脂糖凝胶中电泳36～48h，再经Southern印迹将DNA转移至尼龙膜（Hybond TM -N+，Amersham）上，固定后置于预杂交液中（0，5M Na-PO 4 pH7.2，7%SDS，0.1%鲑鱼精DNA，lmM EDTA），65℃预杂交3h，加入变性后的探针继续于65℃杂交12h ［6］ 。-70℃放射自显影3～7d，冲片后分析结果。
2 结果
用覆盖dystrophin全长56.3%的上述5个cDNA探针，从41名病人中检出22例有基因突变，占全部患者的53.66%。其中DMD病人17名，占DMD病人的56.7%（17/30）;BMD病人5名，占其患者数的45.4%（5/11）。22例基因突变中，21例为基因缺失，另1例为存在一异常的连接片段，其具体突变类型未被检出。如表1所示。
3 讨论
3.1 缺失突变 从表1中看到，21例缺失不规则地分布在cDNA检测区。缺失相对集中在两个区域:cD-NA 8 检测区（15例，占71%）和cDNA 1-2a 检测区（5例，占24%）。cDNA 5b-7 和cDNA 9 检出的9例缺失中，有8例缺失区延伸至cDNA 8 检测区。这种缺失区分布特征与国外大综报道一致 ［7］ 。
缺失所累及的外显子数目不一，或为一个，或达28个。每个外显子受累频度亦不相同，或为1次，或为13次（48号外显子），见表1。外显子受累频率为PCR检测患者提供了参考依据。
表1 41例DMD/BMD患者的缺失情况（略）
Tab1 Deletions Of41DMD/BMD Patients
*注:本组患者中共有21例患者存在缺失突变。Note:21cases with deletion mutations.
Dystrophin基因位于Xp21区带，长达2300Kb，是迄今所知最长的一个基因 ［8］ 。该基因外显子9-60之间有26个同源顺序，它们在姊妹染色体分裂过程中较容易发生染色体内同源顺序重组，造成同源顺序间的DNA丢失 ［7］ 。由于同源顺序多，分布广泛，同源顺序重组致使DNA断裂点多，缺失位置和范围不定，可以解释DMD/BMD患者dystrophin基因内形式多样的缺失突变。
3.2 根据整码缺失部位推测dystrophin基因的关键区 移码突变致使外显子缺失及与其相连的外显子遗传密码的变化，影响到dystrophin的半胱氨酸富集区和C末端，从而根据移码突变不易判定dystrophin的关键区段。而通过分析整码缺失则有可能达到此目的。如表2对患者临床表型、起病年龄和整码缺失区域进行对比分析后，我们推测dystrophin基因的关键区之一位于50和51号外显子。从表2中看到，外显子整码缺失较少的12号和19号患者，发病早于缺失数 较多的8号、10号和11号患者。前者1～2岁发病，累及50～51号外显子，后者4～6岁发病，未累及这两个外显子。另2例BMD患者（1和4号患者）外显子整码缺失个数相同，均为3个，分别累及3～5号和47～49号外显子。而后者发病较早（13岁），可能说明47～49号外显子编码的氦基酸序列较重要，这与它们同关键的50～51号外显子相连，并协助50～51号外显子发挥功能有关。
表2 整码缺失突变与临床表现的关系（略）
Tab2 The relation of In-frame deletions and clinical representations
3.3 其它突变类型 本组尚有19例患者（占46.3%）未被检出dystrophin基因组DNA/HindⅢ片段的异常。用cDNA杂交检测的方法，分辨率在400bp以上，故不可能发现基因内的微小突变及点突变。部分探针（cDNA 2b-3，10-14 ）未进行检测，亦遗漏了部分基因突变的检出。据报道，dystrophin基因突变类型尚有重复突变、易位、基因内到位、及影响mRNA后加工的内含子的突变 ［9］ 。
参考文献:
［1］l刘焯霖，梁秀龄［M］.神经遗传病学.北京:人民卫生出版社出版，1988，125.
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［3］Maniatis T，Fritsch EP，Sambrook J（eds）.Large-scale isolation of plas-mid DNA［J］.Molecular cloning-A laboratory manual6th ed.1982，86.
［4］Feinberg AP，Vogelstem B.A technique for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity［J］.Anal Biochera，1983，132:6.
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［6］Wetmur JG and Davidson N.Kinetics ofrenaturation of DNA［J］.J Mol bi-ol，1968，31:349.
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［8］ Koenig M，Hoffman EP，Bertelson CJ，et al.Complete cloning at the Duchenne muscular dystrophy（DMD）eDNA and preliminary genomie orga-nization of the DMD gene in normal and affected individuals［J］.Cell，1987，50:509.
［9］Koemg M，Beggs AH，Moyer M，et al.The molecular basis for Duchenne versus Becket muscular dystrophy correlation of severitywith type of deletion ［J］.Am J Hum Genet，1989，45:498.
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