中药、天然药物注册分类第一类中药新药的药代动力学评价初探

　　（一） 中药药代动力学方法学中存在的问题

1．资料不全面：多为方法学介绍不详细或缺资料，如HPLC法无色谱图（包括空白血浆、组织，以及样品和标准品色谱图等）。有的试验因选用UV 检测，一般情况下干扰较多，尤其是粪便中杂质较多，不提供色图谱就无法判断色谱图所显示的分离程度是否良好；有的试验用GC-MS法，但不提供质量色谱图或未进行积分，或原始资料中显示出用手动积分等，均不妥；有的对图谱中内标峰和待测物峰均不予以标明。

2．稳定性试验：该项试验应包括样品的予处理、冰箱贮存、反复冻融、24小时室温等。但许多资料不提供或未做稳定性试验，或者资料不全。

3．回收率试验与准确性：提供的资料不全，有的仅提供血浆样品回收率，而无组织回收率。有的高、中、低三个浓度下的回收率结果相差过大，回收率不稳定等。

4．精密度测定：不进行或不提供日内或日间精密度考察资料。有的试验中的精密度是基于面积比计算的，这是不正确的，应按当日的标准曲线求出实测浓度值，再由此计算出精密度。

5．灵敏度测定：不进行方法学的探索性研究，寻找增高灵敏度的方法，是导致灵敏度过低，无法真正评价新药药代的最大问题。当然，中药药代动力学方法学建立的难度也是其根本原因。

6．标准曲线的制作：该方面的问题包括：（1）许多资料不提供标准曲线，或仅有血药浓度标准曲线，而无组织样品的标准曲线；（2）试验过程中不做随行标准曲线及质控，有的情况下仅在试验初期做一条标准曲线，即试验过程中缺乏质控样品；（3）线性范围选择不当，过窄或过宽。过窄时，导致实测时的高或低浓度超出了标准曲线，而采用外推法，发生外延现象，即此时的标准曲线不能覆盖整个实测浓度。过宽时，实测浓度仅仅是线性范围内的一个尖，如标准曲线的最高浓度（10000ng/ml）远远超出了实测最高浓度（130ng/ml）；又如线性范围为100-4000ng/ml，但实测最高浓度仅为170mg/ml。（4）未给出最低检出限（LOQ）或LOQ不符合要求，不能检测出3-5个消除半衰期或不能检测出峰浓度Cmax的1/10-1/20的浓度等。另外，对实测值中小于LOQ的数据均未标出“不能定量检测”等说明，因低于LOQ的数据均不可靠。

7．内标选择：内标选择不当而起不到内标的作用。选择了内源性物质做内标，因内源性物质的干扰可能使得检测结果有较大的波动，故可使测定值不准确而影响了评价。这种情况下，分析谱图，可见内标峰的保留时间变化较大，以及内标的基线在生物样品中比标准高许多，因此可提示内标的特异性较低。

　　（二） 中药药代动力学试验中存在的问题

1．给药剂量：试验中剂量选择不合理是一突出问题，如仅选择一个剂量或选择的剂量远远超过药效学有效剂量范围，这样均导致试验不符合要求。原则上应在药效剂量范围内选择3个剂量进行试验。

2．动物：动物的状态不符合要求，如采用麻醉动物进行药代试验；动物数不符合要求，如分布试验中取血时间点较多，而每个时间点设计的动物数过少，仅2-3只动物，在非连续取样的试验中，动物数应至少5只；此外，在进行数据统计时，当数据差异较大时，因无法进行药代参数的推算或为了降低其变异，而采用将几个动物的血样混合后再测定的方法，这种做法是错误的，因实际的动物数仅为1，违法了统计学的要求。另外，多数研究仅利用一种动物，这也是不符合第一类中药新药药代动力学要求的。

3．血药浓度：未提供血药浓度原始数据或未给出每只动物的血药浓度值是经常出现的问题。另外，在测定血药浓度的试验中采血时间的选择不当也是常见问题，如采血时间太短，未按照t/12的长短进行，如t1/2为60min，符合要求的采血时间应为4-5个半衰期长，即240-300min左右，但实际仅观察到给药后18min，此种情况多是由于方法的灵敏度不够，无法再对低浓度的血药浓度进行测定所致。

4．药代参数：该部分的主要问题包括：（1）未能全面提供药代参数，如AUC，T1/2，CL，生物利用度，Vd等；（2）线性动力学确定的依据不足，试验结果显示有的参数（t1/2）符合线性动力学，有的符合（如AUC, Vd等与剂量有明显关系）非线性动力学，但却不对各矛盾的结果进行分析和解释；（3）对参数与文献报道的结果出现很大差异的情况不进行分析或查找原因；（4）三个剂量的参数之间相差较大，如高、中剂量的AUC几乎重叠或增大剂量AUC反而明显降低等；不同给药途径的t1/2相差较大，如肌肉注射和静脉注射的t1/2分别为1.06和0.39小时；不同动物间的差数相差较大，如犬的大鼠的T1/2分别为0.5小时和8-9小时等。当参数出现明显异常时，仅罗列结果，而不对结果进行说明、分析和判断。

5．分布试验：该部分的问题较多。（1）分布试验中考察的指标不全面，如药效学试验与药代动力学研究相分离，不能根据药效靶效应器官进行相关组织分布的测定，如治疗骨质疏松药物的药效靶器官和抗肿瘤药物的毒性靶器官均为骨组织，但却忽视了对骨组织的分布测定等。（应根据药物作用的靶效应器官和靶毒性器官进行组织分布的检测，这对揭示药物作用具有重要作用）（2）对口服给药途径的药物，当发现胃壁和肠壁中分布较高，且粪便排泄率也较高时，应进一步搞清是未吸收造成的直接排泄，还是从肠道排泄，不应仅根据粪排率推算生物利用度。（3）血中浓度测不出，但却有组织分布时，应进一步搞清原因。（与其他药物有相似的代谢特性，则应提供相关的文献资料）。（4）当组织分布的结果与靶效应器官不相符或与药物起效及作用持续的时间不相符时，不做任何解释和分析。如用于心源性休克和冠心病的药物，药效和机制研究的靶器官均为心脏，但药代组织分布测定表明心脏中无任何分布；或给药后短时间内即已测不出组织分布，但药效作用还存在，应进一步分析、解释是因检测灵敏度不够，还是因药物可能在机体内发生了代谢，代谢物是否为发挥药效的物质基础（即应明确是方法学问题，还是物质基础未搞清）。（5）在进行组织分布测定时未同时测定血药浓度，或血药浓度结果与血药浓度试验中的结果发生矛盾，例如某药物给药后某一时间点的血浓为78ng/ml，而相同给药剂量、相同给药后时间点的血药浓度试验中却显示为206ng/ml，相差近3倍，这种情况一般为方法学有问题。（6）分布试验中选择的剂量不符合要求，有的大大超过药效学有效剂量。（7）分布试验中检测总时间选择不当，如有的药物仅测定了给药后40min的组织分布，但其他试验如荷瘤动物分布试验却显示出60min分布达高峰，480min时瘤组织中仍有分布的结果，显然选择40min的观测时间明显不够。另外，检测的各试验点选择不当，如仅选择给药后2个时间点进行分布试验，并不能充分反映出药物在体内的动态分布情况和维持时间。（8）当分布试验的结果显示某一组织内分布异常高时，未结合毒理学研究分析其可能的毒性靶器官。（9）对不同方法测定的组织分布相矛盾的结果不能充分解释和分析，如小鼠3H-标记法和大动物GC-MS法测定的结果显示，小鼠脑和脂肪组织内有药物分布，但大动物这两个组织中却无分布，对此不能作出合理解释，也就不能相应地对长毒试验中出现的神经系统的毒性作出解释。

6．排泄试验：取样时间点选择不当，如尿液收集时无上升支取样点，一下就进入了平台期，必然影响了排泄的时间和量的判断。药物排泄的途径观察的不全面，如当血药浓度测定发现有双峰现象时，未做胆汁排泄试验，因此就不能全面、合理地反映出药物的排泄途径。另外，排泄试验的数据提供的不全面，如仅提供某个时间点的累积排泄率，而不提高每只动物不同排泄途径的实测数据。

7．代谢或生物转化：药物在体内代谢转化的研究是阐明药物进入体内变化，揭示药物及其代谢物在体内消长，以及药理作用和毒性的重要环节。该部分研究也是中药药代动力学研究的难点。几乎全部药代资料均不能提供该部分的试验结果，多数对可能出现代谢物的情况仅通过推测而得出初步结论。如，当色谱图显示出有未知峰时，提示体内可能发生了代谢或转化，在此情况下不进行进一步的研究，仅根据保留时间等间接推测可能的代谢物；当测不出血药浓度时，也未经过代谢研究就盲目地推测药物大部分被代谢，这样推测的依据显然是不充分的。如一般认为甙（苷）口服后在肠道中经肠道菌群水解成甙元（苷元）后才可在小肠下部吸收，而显示药效，但有的试验却不能测出体内存在其代谢产物甙元，因此对发挥药效的物质基础就无从判断。

8．血浆蛋白结合率：许多申报资料忽视了该项测定，而不提供血浆蛋白结合率的资料。有的试验不规范，如选用大鼠血清而不是小牛血清测定，而补充资料中显示两种血清测定的血浆蛋白结合率结果相差很到，如大鼠血清测定值为15%，而小牛血清却为46%。因此，正确的试验方法对评价各项指标起到至关重要的作用。

9．生物利用度：口服给药的品种生物利用度的问题很突出。多数情况均求不出生物利用度或得到不正确的生物利用度的结果。有的因药物的水溶性较低，而强调不能静脉给药，故不提供绝对生物利用度结果，但也不进行相对生物利用度的测定。有的求出的生物利用度明显错误，分析原因，可能主要是因为方法学的灵敏度较低，故导致在口服药效学有效剂量下测不出血药浓度，而盲目通过增大剂量的方法进行试验，这样势必造成口服给药量远远超过静脉注射剂量，如有的药物口服剂量是静脉注射剂量的400倍才能测出血药浓度，因此计算出的生物利用度非常低，仅0.15%左右，这种情况下计算出的生物利用度根本不能如实地反映出药物真正吸收利用的情况。

　　二、几点思考

通过上述对中药药代动力学资料中存在问题的分析和归纳，得出以下几点思考：

　　（一）第一类中药新药进行药动学研究的必要性

　　通过药代动力学研究可确定药物在体内的代谢过程和特点，对该药物是否具备成为新药的条件作出初步判断的基础。通过对药物及其代谢产物体内经时变化的研究，可有利于对其药效强度和毒性作用的时程变化作出相关分析，药代动力学参数也可为毒性试验设计和毒理效应分析提供依据。通过对不同种属动物的药代动力学研究，可阐明药物体内处理的种属差异，为分析药效学的种属差异提供基础。通过对体液和不同组织器官药物浓度的测定，可进行药物体内分布与作用靶器官的相关性分析。只有认清了药物在体内吸收、分布、代谢和排泄的基本规律以及生物利用度，才能为临床制定安全、有效、合理的用药方案提供基础支持。

　　WHO曾强调“对评价药物疗效与毒性来说，药物动力学的研究，不仅在临床前研究阶段，而且在新药的所有阶段都很重要”。中药药动学的研究同样对新药的研发，对提高中药新药的研制水平，对促进中药现代化和中药走向世界都具有极为重要的意义。但由于中药药代动力学研究难度较大，任务艰巨，需要在借鉴化学药物药代动力学研究方法、吸收现代科学知识的同时，在中医药理论的指导下，不断创新、完善、构建适合于中药药动学研究的新理论、新技术和新方法，在逐渐的探索过程中不断地提高。无庸质疑，也正是由于中药药代动力学的难度和困难，更说明进行药代动力学研究的必要性。

　　（二）进行药代动力学特征参数测定的意义

　　可根据吸收速率常数、消除速率常数、半衰期、表观分布容积、生物利用度等，作为中药剂型选择和给药途径选择的依据。如对半衰期较短、给药频繁的药物可制成缓释制剂，对治疗指数窄的药物可制成控释制剂，对在胃肠道不稳定或肝脏首过效应大的药物可制成注射剂或其他非口服制剂等；如多肽、酶类药物口服制剂的生物利用度很低，一般采用注射给药途径。通过对药动学参数的研究，还可优化制备工艺和工艺参数，也可用来评价制剂工艺的优劣等。通过药动学研究得出的药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄等方面的重要资料，可以为今后药物的结构改造提供理论依据和研究方向，以定向寻找、研制出更多的低毒、长效、高效、稳定、剂量小、副作用低的新药。药代动力学的研究结果可用于阐明中医药防病治病的机制，以及科学合理地制定临床给药方案，即妥善设计给药方法，解决合理用药问题（如计算首次剂量、维持剂量、给药间隔时间、给药途径等），以使药物选择性地到达靶器官，并在一定时间内维持有效浓度的水平，从而提高药效，减少不良反应等。

　　（三） 药代动力学研究方法的选择

　　方法学的选择和建立直接影响到药代动力学研究的结果和评价。随着现代科技的发展和配套仪器分析技术的成熟，特别是高效液相色谱仪、气相色谱仪、气质联用色谱仪、液质联用色谱仪、放射性同位素分析等技术应用的日益广泛，已为中药药代动力学研究提供了相当的技术支持和保证。
　　在进行一类中药新药药代动力学研究时应具体采用什么样的分析方法，需要针对药物的特性，如应明确待测药物属于生物碱类、苷类、有机酸类、内酯类，还是其他类型；待测药物的理化性质如何，包括化学结构、分子式、分子量、熔点、溶解度、脂溶性等，这对估计在体内的可能代谢产物，确定提取药物的溶剂系统及予处理方法都有较大的作用；此外，也应了解相关的药效学资料，如动物的有效剂量及临床人拟用量等，这对估计可能的血药浓度范围，考虑测定方法的灵敏度等也都起到相当的作用。当然，在研究或立题的基础阶段就应着重方法学的探索，就应尽量采用较高灵敏度、准确度和专一性的方法，以满足对低浓度药物的测定。以下是目前中药药代动力学研究中常见的两种分析方法。

　　（1） 高效液相色谱法：目前，多数申报药代资料基本采用HPLC法。此方法是70年代发展起来的，特别适合高沸点、大分子和热稳定性差的化合物的分离分析，目前仍是药物分析中最常用的手段。近年来其检测部分有了较大的发展。其中紫外检测法是最常用的检测方法；对小剂量低血浓度的药物，则可考虑采用荧光或电化学检测的方法。另外，利用蒸发光散射检测器对无紫外吸收的化合物，如甾体化合物、人参皂苷等均具有较好的检出灵敏度。中药中有些紫外吸收弱，或无特征紫外吸收的成分，直接用HPLC测定，其灵敏度和分离度均不佳，此时可利用柱前、柱后衍生化的方法，使这些成分较精确地测定出来。

　　（2）气相色谱法：该方法对脂溶性强、易气化的药物的检测为常用手段。气相色谱-质谱联用技术已成熟，该方法综合了气相色谱和质谱的优点（气相色谱的高柱效、高分离性能与质谱的定性功能），弥补了各自的缺陷，因而具有灵敏度高、分析速度快、分辨率高、鉴别能力强的特点，是目前能够达到pg检测水平的方法。现已有部分申报资料开始应用气相色谱-质谱联用的方法，进行药代动力学研究。 尽管申报资料方法学部分还存在许多的问题和不足，但将GC-MS联用技术应用于中药药代动力学研究，已是中药分析手段现代化的重要体现和尝试。我们坚信，随着分析仪器的不断完善与发展，检测技术的成熟与推广，应用范围的扩大，中药药代动力学的方法学研究会日臻完善和提高。

　　（四） 中药药代动力学研究中应注意的问题

　　1． 分析方法建立时应注意的问题

　　方法学考核的内容应完善，包括灵敏度（检测限），精密度（日内变异系数）和重复性（日间变异系数），回收率（准确度），线性（标准曲线），特异性（专属性，选择性）等方面。应清楚说明分析方法的灵敏度、特异性、精密度、回收率和线性范围。其中，特异性是方法建立的关键，只有特异性达到要求后，测得的结果才有意义，要做到这点，必须对生物样品进行有效的分离与选用有足够专一性的检测器。要重视稳定性试验，保证样品处理开始到分析完成的整个过程中样品的予处理、贮藏、冻融、放置等环节的稳定，这对定量结果的可靠性分析是不可缺少的必要条件。标准曲线制作时，生物样品分析中的标准曲线应该是空白生物样品中加入药物后配制成一定浓度，经予处理后测定生物样品的标准曲线，用直接加入流动相内配制的溶液做样品分析的标准曲线的方法是错误的。对分析样品而言，工作曲线的精密度和准确度以及RSD应不超过10%。线性范围选择时，应至少选择5个浓度点，要符合药物有效浓度的范围，即标准曲线应覆盖整个待测样品的浓度范围。最低检测限（LOQ）要至少能检出3-5个消除半衰期后的血药浓度或能检出锋浓度（Cmax）的1/10-1/20的血药浓度。其LOQ检出浓度的信号应达到噪音的10倍，药时曲线消除相的低浓度必须有一定的准确度，对测定的药物浓度在线性范围之外时不能通过外推法求得。在分析样品的过程中，每次应用2-3个随行标准做为质控样品，只有当质控样品代入标准曲线计算的浓度与其靶值比较，其准确度、精密度均符合一定要求时，才可沿用原标准曲线，否则需重新制作新的标准曲线。

　　2． 研究内容方面应注意的问题

　　中药药代动力学方面目前尚无统一的标准，仍按化学药的要求进行。研究的内容应包括药物的吸收、分布、代谢、排泄及蛋白结合率等。若为口服制剂，还应测定绝对生物利用度；若药物在体内被明显代谢，则要求尽量确定药物在动物体内的代谢部位、代谢产物、代谢途径、代谢物活性或毒性等。另外，提供资料时应全面，应尽量提供原始数据和原始图谱等。

　　具体应注意以下问题：（1）样品：必须为原料药（有效成分）或临床制剂，不得使用标准品。（2）体内药物浓度检测方法：应符合生物样品测定要求，应选用适宜的、灵敏度较高的检测方法。（3）动物选择：尽量选择与药效试验相同的动物，必须进行两种动物的药代研究，包括啮齿类和非啮齿类动物。（4）剂量及给药途径的选择：应采用拟推荐的临床给药途径，在药效学有效剂量和长毒剂量区域内选则三个剂量做药时曲线。不能靠随意增大剂量来满足方法灵敏度的不足。（5）药代动力学参数：应提供全面的药代动力学参数， Cmax，Tmax, T1/2醹，T1/2鈣，Vd，Cl等。口服给药应提供生物利用度数据，如无法提供应充分说明理由。（6）应测定血浆蛋白结合率。（7）分布试验：至少应包括心、肝、脾、肺、肾、脑、胃肠道、生殖腺、脂肪组织、骨骼肌等。还应结合药效学作用的靶器官或毒性靶器官观察相应的组织分布。（8）排泄试验：应至少进行尿、粪、胆汁中的排泄量测定。（9）代谢研究：当原型药物的药动学过程不能解释药效时，应研究活性代谢物，对可能的原因做出分析。

　　三、结语