反相高效液相色谱法测定人血浆中甲氧氯普胺

　　 Determination of metoclopramide in human plasma by RP-HPLC

　　【Abstract】  Objective  To develop a method for the determination of metoclopramide in plasma using RP-HPLC. Methods  The internal standard was diazepam， the samples were extracted by ethyl acetate after basified the plasma.， the column was Hypersil C18， and the mobile phase mixed of methanol: water(75:25) containing 0.03%-triethylamine. The detection wavelength was 276nm. Results  The calibration curves were linear when the metoclopramide concentration in serum in range of 3.7～660.0ng/ml， the limit of detection was 2.0ng/ml，method recovery was 92.7%～97.9%，the RSD of within-day and between-day were less than 10%.Conclusion  The method is simple， sensitive and accurate to monitor plasma concentration during clinical pharmacokenitic study of metoclopramide in human.

　　【Key words】  RP- HPLC；metoclopramide;drug concentration in plasma

　　甲氧氯普胺（Metoclopramide，胃复安）为多巴胺受体阻滞剂，具有强大的中枢性镇吐作用，并可促进胃及上部肠段运动，临床上用于治疗癌症放、化疗和手术后的呕吐、反流性食管炎、胆汁反流性胃炎等胃肠道疾病。有关甲氧氯普胺的血清浓度测定方法，国内文献采用紫外薄层扫描［1］，灵敏度低，仅适合大剂量样品，国外文献报道的方法有GC、GC-MS和HPLC［2～4］。本文建立的以地西泮为内标反相高效液相色谱法测定甲氧氯普胺血浓度与文献相比［2］，方法简便、准确、灵敏度高。可用于甲氧氯普胺血清浓度测定及其体内药代动力学研究。

　　1  材料与方法

　　1.1  药品与试剂  甲氧氯普胺、地西泮标准品均购自中国生物制品检定所，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

　　1.2  仪器  HEWLETT-PACKARD1050型高效液相色谱仪，HP35900D化学工作站

　　1.3  色谱条件  色谱柱为Hypersil  ODS C18   4.0mm×250mm  φ5nm；流动相为含0.03%三乙胺的甲醇：水（75：25），流速1.0ml/min；  紫外检测波长276nm，灵敏度0.01AuFS；柱温30℃。

　　1.4  标准溶液配制  精确称取甲氧氯普胺标准液适量，甲醇溶解、稀释，配成0.44mg/ml标准溶液，置4℃冰箱备用。 

　　1.5  内标溶液配制  精确称取地西泮标准品适量，甲醇溶解、稀释，配成0.24mg/ml标准内标溶液，置4℃冰箱备用。

　　1.6  样品处理  取血浆1.0ml于离心管内，加入内标溶液4μl，加入pH 9.0磷酸盐缓冲液0.4ml，加入乙酸乙酯3ml，旋涡震荡2min，以2000r/min速度离心10min，取出乙酸乙酯层后，再次加入乙酸乙酯3ml于离心管内提取，合并2次乙酸乙酯提取液，40℃恒温下氮气吹干，残渣用80μl甲醇溶解，进样20μl。

　　2  实验结果

　　2.1  色谱与分离  本实验条件下，样品提取较干净，甲氧氯普胺峰与内标峰分离完全，血浆内源性杂质对测定无干扰，色谱图见图1、图2。（略）

　　2.2  线性关系与最低检测限  分取空白血浆1ml，分别加入适量甲氧氯普胺标准溶液，配成3.7ng/ml、11.0ng/ml、33.0ng/ml、110.0ng/ml、330.0ng/ml、660.0ng/ml系列标准溶液，按前述样品处理方法提取，进样。以甲氧氯普胺与地西泮二者峰面积比值（Y）和甲氧氯普胺血浓度（X）进行回归，得回归方程：Y=0.0021X+0.0141，r=0.998；本实验条件下甲氧氯普胺最低检出限为2.2 ng/ml。

　　2.3  萃取回收率  精取4份44μg/ml甲氧氯普胺标准溶液6μl，各加入内标液4μl，其中3份再加入血浆800μl，按前述提取方法提取，进样，测得甲氧氯普胺、内标地西泮峰面积；其中另一份直接氮气吹干，加入80μl甲醇溶解，进样 20μl，测得甲氧氯普胺、内标地西泮峰面积；前3份样品中的甲氧氯普胺和地西泮各自峰面积平均值分别与后一份样品中的甲氧氯普胺和地西泮峰面积值相比，得到甲氧氯普胺萃取回收率为92.2%，地西泮萃取回收率为90.7%。

　　2.4  方法回收率试验  分取空白血浆0.8ml，精确加入甲氧氯普胺标准溶液适量，使其血浓度为11.0 ng/ml、110.0 ng/ml、660.0 ng/ml，按前述样品处理方法处理进样，以测定值与加入值的比值计算加样回收率，结果见表1。表1  甲氧氯普胺方法回收率试验  （略）

　　2.5  精密度试验  分取11.0 ng/ml、110 ng/ml、660.0 ng/ml三浓度甲氧氯普胺标准血样0.8ml各6份，按前述样品处理方法进样，计算日内差；每日测定，连续测定6天，计算日间差，结果见表2。表2  甲氧氯普胺精密度试验  （略）

　　3  临床应用

　　25例抽动秽语综合征患者日服甲氧氯普胺15～80mg，连续服药2周后， 分别抽取早晨给药前及给药后45min血样，按样品处理方法提取，测定。测得25例患者给药前血药浓度2.7～68μg/L，平均(25.1±19.1)μg/L；给药45min后血药浓度6.8～212.9μg/L，平均(62.0±48.5)μg/L。

　　4  讨论

　　4.1  提取条件选择  文献报道甲氧氯普胺血样采用三氯甲烷2次提取［2］，本文在实验中发现，三氯甲烷与血浆振荡时易乳化，且氯仿层在下层，不易吸取，样品有较大损耗。后经摸索，改用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯与血浆较易分层，且乙酸乙酯位于上层，便于吸取，且样品提取较完全。

　　4.2  色谱条件选择  本文曾参考文献［2］，采用甲醇：1%HAC的不同配比为流动相，发现甲氧氯普胺色谱峰拖尾严重，峰型差，后加入三乙胺，拖尾现象得到抑制，其出峰时间也提前，经摸索采用含0.03%三乙胺的甲醇：水（75：25）为流动相，甲氧氯普胺与内标峰得到完全分离，且峰型较好，柱效高，提高了甲氧氯普胺检测灵敏度。

　　4.3  检测波长选择  采用流动相为溶媒，对甲氧氯普胺进行 200～500nm紫外扫描，得221.2 nm、276.2 nm、310.0 nm三个最大吸收波长，其中276.2nm处吸收值略高于其他二波长，故采用276nm为样品紫外检测波长。

　　4.4  本实验建立的反相高效液相色谱法测定人血浆中浓度方法  方法准确、灵敏度高，可最低测至2.2ng/ml浓度血样，通过对临床抽动秽语综合征患者甲氧氯普胺血浓度监测，表明该方法能够满足甲氧氯普胺生物样品分析需要。

　　【参考文献】

　　1  黄圣凯，路洪，朱庆琪，等.  人血浆中胃复安的紫外薄层扫描测定法.  中国临床药理学杂志，1986，2(2):70.

　　2  Bishop-Freudling G B， Vergin H.  Determination of metoclopramide in human plasma by HPLC.  J  Chromatogr，1983，273:453.

　　3  Bsteman D N，  Kahn C，  Mashiter K， et al.  Pharmacokinetics and concentration-effect studies with intravenous metoclopramide.  Br J Clin Pharmacol，1978，6:401.