DNA指纹图谱技术及其在中药研究中的应用
http://www.51xue.org.cn 2007/6/19 源自:互联网 【字体：
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从20 世纪50年代DNA双螺旋学说的提出到60年代基因学说的出现,从70年代DNA限制性内切酶的发现到80年代PCR技术的出现,分子生物学发展迅猛。基因工程等生物新技术的不断出现和发展,为人们研究解决问题提供了新的思路和方法。分子生物学技术迅速被应用到医学、农学、分类学、法医学等许多领域,并取得了巨大成就。近年来,中医药工作者将分子生物学理论和技术引入到自己的研究领域,并取得了令人瞩目的成果,对中医药学的现代化进程产生了积极的推动作用。
1 DNA 指纹图谱的概念
核苷酸序列是生命有机体构建、维持和繁殖生命所必需的遗传信息。不同种生物体含有不同的DNA序列,同种生物体既有相同的DNA序列,保持同种生物体的遗传性状,又具有多态性,这种多态性可以是个体、种属或变异等引起的,它使得同种生物中的各个体千差万别,生物多样性正是由于其基因多态性的结果。由于这种核苷酸序列是相对稳定的,因而可以利用现代分子生物学技术构建DNA指纹图。如将生物体DNA模板进行PCR扩增,不同生物体得到的DNA 片段的大小、数目不同,再将这种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结果显示的DNA 带型差异在紫外下成像,从而得到DNA指纹图。DNA指纹图谱具有高度的个体特异性。在分子水平上检测基因多态性,比形态、组织和化学水平上检测更能代表其变异类的遗传标记,其鉴别结果更加准确可靠。DNA指纹技术灵敏度高,如果选择合适的扩增引物,其结果的重复性也非常好。
2 DNA 指纹图谱的建立
国外在70 年代发展起来的DNA片断分析技术——限制性内切酶片段长度多态性标记( Restriction Fragment Length Polymorphism ,RFLP) 在许多领域都有成功的应用,也常用于构建中药DNA指纹图谱。限制性内切酶能高度专一地识别和切割DNA序列,不同酶识别不同的DNA序列,因此可利用内切酶的酶解产生不同长度的DNA片段,从而揭示DNA序列水平上的多态性。酶解后的分子量大小不同的DNA可通过凝胶电泳来分离,再将已分离的DNA 与放射性核试验素或荧光标记的核酸探针分子杂交,便可获得信息量大、分辨率高的DNA指纹图。
但目前人们已普遍感到RFLP方法技术步骤繁琐,费时费力,应用不便。自80年代中期PCR技术诞生以来,因其操作简便、不需使用同位素、灵敏度高、特异性强等优点,迅速被应用于相关领域。从常规PCR发展而来的应用随意引物扩增的随机扩增多态性DNA 标记(Radon Amplified Polymorphic DNA ,RAPD) 或称任意引物PCR(arbitrarily Primer PCR ,AP2PCR) 解决了未知特异DNA 序列基因组的扩增问题,它采用任意顺序的引物扩增基因组DNA,可以在不知道特异DNA序列的情况下,检测DNA的多态性。RAPD技术目前广泛用于中药DNA指纹图谱的构建,在目前绝大多数药用动植物DNA序列还未知的情况下,RAPD技术具有广阔的应用前景。PCR技术的诞生使目的基因极易获得,再与RFLP 联用,还产生了PCR-RFLP、RAPD-RFLP 等方法。RAPD技术的一般步骤如下。
2.1 DNA 提取、纯化与检测 总DNA提取常采用Doyle等的CTAB法,或作适当改进。称取0.5～1g的新鲜或干燥叶片或根组织,置小研钵中,加入液氮迅速研磨成粉末,转移到小离心管中,立即加入预热60℃的CTAB提取液(含CTAB、Tris-HCl、EDTA、NaCl、PVP、β-硫基乙醇等),60℃水浴1h或65℃水浴40min,用等体积的氯仿:异戊醇(CI ,24:1) 抽提,离心;取上层水相,加1/10体积的10%CTAB/0.7mol/LNaCl溶液,轻轻混匀,再加入等体积的CI(24 :1)抽提,离心;取上层水相加入2/3体积预冷的乙醇或异丙醇沉淀DNA,离心,取DNA沉淀,用75%左右的乙醇洗涤2～3 次,干燥后溶于TE 溶液(pH8.0) 中,用RNA 酶酶解或用玻璃奶法纯化,得DNA 样品。将DNA 样品在018 %琼脂糖凝胶上进行电泳,检测DNA片段的长度并估测DNA的浓度。
2.2 PCR 反应 24μL 的PCR 反应体系包括:5μmol/L的引物,2μL ,2mmol/L dNTPslμL ,10×buffer (含20mmol/L 1Mg-Cl2) 2.5μL ,5u/μL Taq DNA 聚合酶0.2μL ,10ng/μL模板DNA 2μL 和灭菌双蒸水17.3μL 。PCR 反应程序为:94 ℃5min ,37℃1min ,72℃ 2min ,此程序2个循环后接94℃ 1min ,36℃1min ,72℃ 2min ,38 个循环后接72℃ 10min。每个引物均以2μL 灭菌双蒸水作对照。
2.3 PCR 扩增产物的检测 PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mLEB)上电泳,电泳结果在透射式紫外灯下观察并照相。
2.4 数据分析 电泳图谱中的每一条带均为一个分子标记,代表在DNA模板上有一个引物结合位点,不同的样本在凝胶上泳动距离相同则表示它们有相同的位点。可用二元数据(1 ,0) 统计来表示带的有无,用RAP Distance 软件进行数据输入,计算样品间的遗传距离,然后用NTSYS-pc 软件进行聚类分析,用UPGMA 法作聚类图。
90 年代Zabean及Vos等发明、发展了一种高效检测DNA 多态性的新方法,称为扩增片段长度多态性DNA(Ampli-
fied Fragment Length Polymorphism ,AFLP)。该方法用一人工接头(adapter) 与限制酶切的基因组DNA片段连接,制成AFLP模板DNA,合成一系列3′2末端随机改变数个碱基的PCR 引物进行PCR 特异条件的扩增,经电泳分离检测后可得到DNA指纹图谱。一次实验可检测约50～100个扩增产物,与RFLP、RAPD比较,AFLP 法构建的DNA 指纹图谱具有效率高、重复性好、灵敏度高的优点,而且所检测到的大多数扩增片断与基因组的单一位置对应,展示了AFLP 技术特别适合品种鉴定的应用价值和广阔前景。
3 DNA 指纹图谱在中药研究中的应用
DNA 指纹图谱技术是在分子水平上、以药材基因型特征为鉴定指标的一种新技术,它直接分析遗传物质本身,是分析生物的基因型而非表现型,排除了环境因素给药材鉴定带来的干扰,也不受样品形态(药材原植物、饮片或粉末) 和材料来源的影响,比传统的方法(性状、显微、化学、理化鉴定) 更准确可靠,它不仅能区分相近物种(同科、同属不同种) ,而且可以检测外型极为相似的同种不同变种、变型、品系、化学型乃至个体之间的DNA 的细微变异。这一技术近年来正越来越广泛地被应用于中药研究中。
3.1 中药鉴别 中药材真伪鉴别及品种鉴定是目前DNA指纹图谱技术在中药研究中应用最多的一个领域。目前药材市场上还大量存在不同替代品混用的现象,不同地区同名异物入药,或是紧俏药材使用其近缘植物入药,甚至使用其它伪品假冒名贵药材。尽管药材在干燥过程中DNA有所降解,但干品仍然带有足够多的DNA 信息特别是稳定的小分子带,可供鉴别药材使用,因此,不论新鲜药材还是干品饮片,或是不同药用部位,通过DNA指纹图谱技术皆能准确予以鉴别。近年来这方面的研究较多,如人参、西洋参的鉴别,西洋参及其伪品的鉴别,人参不同栽培品种鉴定,山参、园参与西洋参指纹图鉴别,厚朴及其伪品的鉴别,大黄正伪品的鉴别,不同产地牛蒡子DNA 指纹图谱鉴别,金银花品种鉴定等等。
3.2 道地药材品质评价与中药材GAP的实施 中药材的质量除了与药材特定的生长环境和特殊的采收加工技术有关外,还与该药材产区内这一物种的地方种群或居群中遗传上的特殊性有关,这就是药材的“道地性”。但以前对道地药材“道地性”的研究仅限于化学、药理学方面。通过DNA 分子手段和化学、药理学手段结合对道地药材进行研究,并进一步对遗传因素和环境因素在药用植物有效成分形成中的地位及其相互作用的关系进行研究,能更好地对道地药材、名优药材进行品质评价,这对指导道地药材的科学栽培、饲养和药用优良品种的
选育具有重要意义。通过对道地药材DNA 指纹的认定,还可提供划分药材档次的分子标记。同时,由于国家正在实施中药材GAP,而实施GAP的基础是保证药材引种的准确性,在此DNA指纹图谱更体现出它的技术优势和重要意义,以及广阔的应用前景。政府有关部门应适时建立相应的种质鉴定机构, 将DNA 指纹图谱技术转化为生产力,这将有力地促进中药材生产的标准化、产业化和现代化。
3.3 动、植物中药种质资源研究与遗传育种 DNA 指纹图谱应用于中药研究的一个重要意义在于揭示了化学成分变化的遗传本质。每一种中药材,由于遗传背景不同,其产生的次生代谢产物也不同,化学多样性是包含在遗传多样性之中的。研究表明,化学成分的变化与DNA 多态有极强的关联性,甚至认为DNA指纹可以作为定量的化学标示。当然,除了遗传因素,中药化学成分的种类及其含量与其生长环境、采收加工等也是密切相关的。
在中药材的种质资源开发利用中,基因多态性是一种宝贵的财富。对于遗传多样性水平较低的品种,应尽可能获得更多的变异类型,可在自然界中寻找、收集变异植珠,或通过分子生物技术手段增加其自然变异率,如体细胞克隆变异、γ或UV射线致突变、原生质体培养等方法。DNA 指纹技术可用于药材个体或群体的变异观察。分析这些变异类型的遗传分化程度及遗传多样性水平,对药材的选种有重要意义。通过DNA指纹技术分析药材不同品种的遗传关系及其差异性,可为药效学相关基因和抗病基因的定位提供重要信息,推动药材遗传育种的进程,如山参与栽培园参的杂交育种,同时为今后分离有价值的药用动植物目的基因打好基础,并为构建药用动植物基因库提供资料。重要动植物基因的克隆,对中药保护和资源利用有重要意义。建立中药材尤其是濒危药用动植物和我国特有物种的DNA 指纹图谱,可使我们更好地从遗传多样性上保护中药的基因资源,防止资源流失。利用转基因技术,可以有目的地改变某些中药的成分,从中获得高效而廉价的抗病组分,转基因技术目前已用于培植高效、特效中药材方面。国外也正利用分子生物学技术增加银杏的自然变异率,以提高银杏内酯的变异性。
3.4 中药复方制剂质量控制 目前中药复方制剂运用DNA指纹图谱技术进行质量控制的研究和报道少见,原因可能由于很多复方中成药制剂中总DNA含量极少,有的在生产过程中已被作为杂质处理掉,从复方成药中提取纯化DNA很困难。但在部分含有药材原粉的中成药制剂中,由于其药材总DNA的破坏程度相对较小,而DNA 指纹图谱技术如RAPD只需微量的总DNA便可进行研究,因此笔者认为,DNA指纹图谱技术对这些含药材原粉的复方成药制剂也有较为实际的用途。
1 DNA 指纹图谱的概念
核苷酸序列是生命有机体构建、维持和繁殖生命所必需的遗传信息。不同种生物体含有不同的DNA序列,同种生物体既有相同的DNA序列,保持同种生物体的遗传性状,又具有多态性,这种多态性可以是个体、种属或变异等引起的,它使得同种生物中的各个体千差万别,生物多样性正是由于其基因多态性的结果。由于这种核苷酸序列是相对稳定的,因而可以利用现代分子生物学技术构建DNA指纹图。如将生物体DNA模板进行PCR扩增,不同生物体得到的DNA 片段的大小、数目不同,再将这种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结果显示的DNA 带型差异在紫外下成像,从而得到DNA指纹图。DNA指纹图谱具有高度的个体特异性。在分子水平上检测基因多态性,比形态、组织和化学水平上检测更能代表其变异类的遗传标记,其鉴别结果更加准确可靠。DNA指纹技术灵敏度高,如果选择合适的扩增引物,其结果的重复性也非常好。
2 DNA 指纹图谱的建立
国外在70 年代发展起来的DNA片断分析技术——限制性内切酶片段长度多态性标记( Restriction Fragment Length Polymorphism ,RFLP) 在许多领域都有成功的应用,也常用于构建中药DNA指纹图谱。限制性内切酶能高度专一地识别和切割DNA序列,不同酶识别不同的DNA序列,因此可利用内切酶的酶解产生不同长度的DNA片段,从而揭示DNA序列水平上的多态性。酶解后的分子量大小不同的DNA可通过凝胶电泳来分离,再将已分离的DNA 与放射性核试验素或荧光标记的核酸探针分子杂交,便可获得信息量大、分辨率高的DNA指纹图。
但目前人们已普遍感到RFLP方法技术步骤繁琐,费时费力,应用不便。自80年代中期PCR技术诞生以来,因其操作简便、不需使用同位素、灵敏度高、特异性强等优点,迅速被应用于相关领域。从常规PCR发展而来的应用随意引物扩增的随机扩增多态性DNA 标记(Radon Amplified Polymorphic DNA ,RAPD) 或称任意引物PCR(arbitrarily Primer PCR ,AP2PCR) 解决了未知特异DNA 序列基因组的扩增问题,它采用任意顺序的引物扩增基因组DNA,可以在不知道特异DNA序列的情况下,检测DNA的多态性。RAPD技术目前广泛用于中药DNA指纹图谱的构建,在目前绝大多数药用动植物DNA序列还未知的情况下,RAPD技术具有广阔的应用前景。PCR技术的诞生使目的基因极易获得,再与RFLP 联用,还产生了PCR-RFLP、RAPD-RFLP 等方法。RAPD技术的一般步骤如下。
2.1 DNA 提取、纯化与检测 总DNA提取常采用Doyle等的CTAB法,或作适当改进。称取0.5～1g的新鲜或干燥叶片或根组织,置小研钵中,加入液氮迅速研磨成粉末,转移到小离心管中,立即加入预热60℃的CTAB提取液(含CTAB、Tris-HCl、EDTA、NaCl、PVP、β-硫基乙醇等),60℃水浴1h或65℃水浴40min,用等体积的氯仿:异戊醇(CI ,24:1) 抽提,离心;取上层水相,加1/10体积的10%CTAB/0.7mol/LNaCl溶液,轻轻混匀,再加入等体积的CI(24 :1)抽提,离心;取上层水相加入2/3体积预冷的乙醇或异丙醇沉淀DNA,离心,取DNA沉淀,用75%左右的乙醇洗涤2～3 次,干燥后溶于TE 溶液(pH8.0) 中,用RNA 酶酶解或用玻璃奶法纯化,得DNA 样品。将DNA 样品在018 %琼脂糖凝胶上进行电泳,检测DNA片段的长度并估测DNA的浓度。
2.2 PCR 反应 24μL 的PCR 反应体系包括:5μmol/L的引物,2μL ,2mmol/L dNTPslμL ,10×buffer (含20mmol/L 1Mg-Cl2) 2.5μL ,5u/μL Taq DNA 聚合酶0.2μL ,10ng/μL模板DNA 2μL 和灭菌双蒸水17.3μL 。PCR 反应程序为:94 ℃5min ,37℃1min ,72℃ 2min ,此程序2个循环后接94℃ 1min ,36℃1min ,72℃ 2min ,38 个循环后接72℃ 10min。每个引物均以2μL 灭菌双蒸水作对照。
2.3 PCR 扩增产物的检测 PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mLEB)上电泳,电泳结果在透射式紫外灯下观察并照相。
2.4 数据分析 电泳图谱中的每一条带均为一个分子标记,代表在DNA模板上有一个引物结合位点,不同的样本在凝胶上泳动距离相同则表示它们有相同的位点。可用二元数据(1 ,0) 统计来表示带的有无,用RAP Distance 软件进行数据输入,计算样品间的遗传距离,然后用NTSYS-pc 软件进行聚类分析,用UPGMA 法作聚类图。
90 年代Zabean及Vos等发明、发展了一种高效检测DNA 多态性的新方法,称为扩增片段长度多态性DNA(Ampli-
fied Fragment Length Polymorphism ,AFLP)。该方法用一人工接头(adapter) 与限制酶切的基因组DNA片段连接,制成AFLP模板DNA,合成一系列3′2末端随机改变数个碱基的PCR 引物进行PCR 特异条件的扩增,经电泳分离检测后可得到DNA指纹图谱。一次实验可检测约50～100个扩增产物,与RFLP、RAPD比较,AFLP 法构建的DNA 指纹图谱具有效率高、重复性好、灵敏度高的优点,而且所检测到的大多数扩增片断与基因组的单一位置对应,展示了AFLP 技术特别适合品种鉴定的应用价值和广阔前景。
3 DNA 指纹图谱在中药研究中的应用
DNA 指纹图谱技术是在分子水平上、以药材基因型特征为鉴定指标的一种新技术,它直接分析遗传物质本身,是分析生物的基因型而非表现型,排除了环境因素给药材鉴定带来的干扰,也不受样品形态(药材原植物、饮片或粉末) 和材料来源的影响,比传统的方法(性状、显微、化学、理化鉴定) 更准确可靠,它不仅能区分相近物种(同科、同属不同种) ,而且可以检测外型极为相似的同种不同变种、变型、品系、化学型乃至个体之间的DNA 的细微变异。这一技术近年来正越来越广泛地被应用于中药研究中。
3.1 中药鉴别 中药材真伪鉴别及品种鉴定是目前DNA指纹图谱技术在中药研究中应用最多的一个领域。目前药材市场上还大量存在不同替代品混用的现象,不同地区同名异物入药,或是紧俏药材使用其近缘植物入药,甚至使用其它伪品假冒名贵药材。尽管药材在干燥过程中DNA有所降解,但干品仍然带有足够多的DNA 信息特别是稳定的小分子带,可供鉴别药材使用,因此,不论新鲜药材还是干品饮片,或是不同药用部位,通过DNA指纹图谱技术皆能准确予以鉴别。近年来这方面的研究较多,如人参、西洋参的鉴别,西洋参及其伪品的鉴别,人参不同栽培品种鉴定,山参、园参与西洋参指纹图鉴别,厚朴及其伪品的鉴别,大黄正伪品的鉴别,不同产地牛蒡子DNA 指纹图谱鉴别,金银花品种鉴定等等。
3.2 道地药材品质评价与中药材GAP的实施 中药材的质量除了与药材特定的生长环境和特殊的采收加工技术有关外,还与该药材产区内这一物种的地方种群或居群中遗传上的特殊性有关,这就是药材的“道地性”。但以前对道地药材“道地性”的研究仅限于化学、药理学方面。通过DNA 分子手段和化学、药理学手段结合对道地药材进行研究,并进一步对遗传因素和环境因素在药用植物有效成分形成中的地位及其相互作用的关系进行研究,能更好地对道地药材、名优药材进行品质评价,这对指导道地药材的科学栽培、饲养和药用优良品种的
选育具有重要意义。通过对道地药材DNA 指纹的认定,还可提供划分药材档次的分子标记。同时,由于国家正在实施中药材GAP,而实施GAP的基础是保证药材引种的准确性,在此DNA指纹图谱更体现出它的技术优势和重要意义,以及广阔的应用前景。政府有关部门应适时建立相应的种质鉴定机构, 将DNA 指纹图谱技术转化为生产力,这将有力地促进中药材生产的标准化、产业化和现代化。
3.3 动、植物中药种质资源研究与遗传育种 DNA 指纹图谱应用于中药研究的一个重要意义在于揭示了化学成分变化的遗传本质。每一种中药材,由于遗传背景不同,其产生的次生代谢产物也不同,化学多样性是包含在遗传多样性之中的。研究表明,化学成分的变化与DNA 多态有极强的关联性,甚至认为DNA指纹可以作为定量的化学标示。当然,除了遗传因素,中药化学成分的种类及其含量与其生长环境、采收加工等也是密切相关的。
在中药材的种质资源开发利用中,基因多态性是一种宝贵的财富。对于遗传多样性水平较低的品种,应尽可能获得更多的变异类型,可在自然界中寻找、收集变异植珠,或通过分子生物技术手段增加其自然变异率,如体细胞克隆变异、γ或UV射线致突变、原生质体培养等方法。DNA 指纹技术可用于药材个体或群体的变异观察。分析这些变异类型的遗传分化程度及遗传多样性水平,对药材的选种有重要意义。通过DNA指纹技术分析药材不同品种的遗传关系及其差异性,可为药效学相关基因和抗病基因的定位提供重要信息,推动药材遗传育种的进程,如山参与栽培园参的杂交育种,同时为今后分离有价值的药用动植物目的基因打好基础,并为构建药用动植物基因库提供资料。重要动植物基因的克隆,对中药保护和资源利用有重要意义。建立中药材尤其是濒危药用动植物和我国特有物种的DNA 指纹图谱,可使我们更好地从遗传多样性上保护中药的基因资源,防止资源流失。利用转基因技术,可以有目的地改变某些中药的成分,从中获得高效而廉价的抗病组分,转基因技术目前已用于培植高效、特效中药材方面。国外也正利用分子生物学技术增加银杏的自然变异率,以提高银杏内酯的变异性。
3.4 中药复方制剂质量控制 目前中药复方制剂运用DNA指纹图谱技术进行质量控制的研究和报道少见,原因可能由于很多复方中成药制剂中总DNA含量极少,有的在生产过程中已被作为杂质处理掉,从复方成药中提取纯化DNA很困难。但在部分含有药材原粉的中成药制剂中,由于其药材总DNA的破坏程度相对较小,而DNA 指纹图谱技术如RAPD只需微量的总DNA便可进行研究,因此笔者认为,DNA指纹图谱技术对这些含药材原粉的复方成药制剂也有较为实际的用途。
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