中药川芎指纹图谱的相似性研究

1 前言
　　1.1 中药指纹图谱
　　国外关于植物药色谱指纹图谱的研究论文日渐增多。他们提出的色谱指纹图鉴别，目的是解决成分复杂、有效成分不明的草药在生产加工的检测和证明产品批间质量的稳定。美国FDA允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图谱。WHO在2000年草药评价指导原则中已有规定，如在植物药的制备及成品的章节中提到，如果草药的活性成分不明，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量一致[1-4]。
　　一直以来，我国的中药研究，大多追随国外的研究方法，侧重于药用成分的发现和分离。但是，中药是协同作用的复杂体系（药效必须通过其内在多种成分相辅相成的作用才能发挥出来），这意味着简单的把当中的某种成分提取出来进行质量检测，不能达到评价其药效的目的[5]。我们需要把中药内在的信息全面地、综合地反映出来，而体现系统性、特征性和稳定性三大原则的指纹图谱正是符合了这个要求。

　　1.2 相似性评价方法
　　中药指纹图谱我们可以通过色谱等分析仪器获得。但是，如果评价不同批次的中药指纹间的差异的方法不科学，指纹图谱对中药质量控制的作用就难以发挥。本研究的目的是探究现今的广泛应用的相似性评价方法对中药指纹相似性评价时存在的问题。
　　目前研究中药指纹图谱常采用的方法，如投影法、向量夹角余弦（点积）法、相关系数法[8]。先做如下定义，一个中药的指纹为一个向量X（或Y），向量的元素是中药中各个成分。即 或者 ，其中n为共有成分的数目。
　　1.2.1 向量余弦法
　　向量余弦法是根据几何学多维空间的向量夹角的启发，把两个指纹当作两个向量，计算起夹角余弦相似度：

　　1.2.2 简单相关系数
　　相关系数与变量单位无关，对各特征变量值上的大小不敏感，忽略了变量值大小之间的差异, 变量值的大小差异对特征变量的变化模式影响不大，它是测度样品间在特征变量的变化模式上相似形状的相似性，又称为形状测度，是鉴别样品真伪，提供定性信息的相似度：

　　1.2.3 主成分分析
　　主成分分析应用一种降维的思想，把每个指纹图谱看作一个多维的向量，用线性代数的数学方法计算出每个向量在第一第二主轴上的得分，再用其做出PCA图，图上每一个点代表一个指纹图谱，从PCA点的分布状况，可以直观地分辨出各个指纹之间的异同。但这个方法也有其不足之处，再本文中有所讨论。

　　2 实验内容
　　2.1 川芎药材
　　本次实验的三批川芎药材从民用药房中购买，产地分别为四川，广东，江西。所得川芎药材为褐色片状，磨粉后过40目标准筛，所得样品粉末按产地分别用玻璃瓶装好，避光存放备用。
　　2.2 样品制备
　　称取0.500g川芎粉末，置于至10.0m容量瓶，用甲醇（AR，广州试剂厂）定容，35摄氏度下超声萃取18分钟。所得溶液过0.20微米滤膜，直接进样。
　　2.3实验仪器
　　Agilent（HP）1100高效液相色谱仪：四元低压梯度泵；二极管阵列检测器（中山大学中心实验室提供）
　　2.4 色谱条件
　　色谱柱： Kromsil C18 反相色谱柱，0.5*25*4.6 mm i.d
　　流动相： 流动相A 为0.5％乙酸水溶液（怡宝蒸馏水）；流动相B 为甲醇（分析纯）
　　流动梯度：0―3min 32%B ; 3－20min 32－65%B ; 20－36min 65－85%B; 36－48min 85－100%B ; 48－60min 100%B
　　流速： 0.8 mL/min
　　柱温： 30. 0℃
　　观测波长：294 nm
　　进样量： 20μL（进样阀自动控制）
　　单次测量时间： 60min
　　2.5 实验方案
　　三个产地的川芎粉末分别取两次样品，每个样品连续进五针（一个实验日完成），共得到同一制备条件下的30（2×5×3）个川芎指纹图谱。

　　3．结果与讨论
　　3.1 川芎指纹图谱
　　3.1.1 重现性
　　按文献[8]报道，川芎药材的提取液存放8小时后，阿魏酸会发生变化；因此样品的测量严格控制在制样后8小时内完成。每个实验日制备一个样品，连续进样5针，15个共有峰的RSD 在5％以内；保留时间变化在1min之内，符合指纹图谱要求。
　　同样实验条件下，使两个实验日相隔一星期，合拼实验结果，得到共有峰的RSD在5％以内。
　　3.1.2 精密度
　　三产地的川芎样品在相同的色谱测量条件下，连续进样5针，得指纹图谱共有峰的RSD在5％以内；连续做两个实验日，共10针，15个共有峰的峰面积的RSD也在5％以内。
　　3.1.3 指纹图谱
　　3.2 相似性分析
　　3.2.1相似系数分析
　　各产地10个指纹图谱取平均值，运用公式1.1和1.2进行向量余弦法分析和相关系数，得到四川，广东和江西三个产地两两比较的相似系数，如表Ⅱ。
　　从余弦系数比较中可以看出，不同产地之间的川芎之间：广东和四川两个产地的川芎的相似系数偏离不大，为0. 977和0.969，可以认为没有显著性差异；而江西川芎与四川和广东两地之间的差异较大，两个系数值在0.8左右。
　　3.2.2 主成分分析
　　我们把30 个川芎的指纹图谱数据，每个指纹图谱作为一个向量，用PCA法分析，得投影图图Ⅱ。从PCA 图中可以看出，30个指纹数据分为3个集中点，分别代表三个产地。证明PCA 作图分析能形象地展示出各个色谱指纹之间的差异。而从三个聚集区域的距离可以看出，江西川芎和其他两个地区的川芎有较大的差异。
　　3.3结果讨论
　　从实验的数据来看，运用高效液相色谱法能为中药川芎的指纹图谱建立提供稳定、可靠的数据。我们的讨论重点放在化学计量学上各种相似性的研究方法的可行性上。从上面的夹角余弦法法，简单相关系数法以及主成分分析（PCA）中，我们都能成功地把三个产地的川芎区分开来，得到比较一致的结论。下面我们探讨一下这些方法在指纹图谱相似性评价中的存在问题：
　　一．这些方法虽然都能把各个产地之间川芎的差异性表示出来（前三个方法运用数字化的指标，而PCA 法有直观的图像），但是，它们无法对这些异同给出一个统计学上的评价，即究竟差异多大才能判断两个中药的图谱之间存在显著性的差异。
　　二．内在的一致性的问题。这些分析方法对于同一产地川芎在重复测试当中存在的差异性无法评价。我们以四川川芎10个指纹图谱为例说明这个问题。图Ⅲa是四川川芎独立做PCA 分析的投影图，表Ⅲ是这10个指纹的相似系数。
　　从图中可以看出，十个样品分布比较均匀，但也存在一定的线性趋向，而且两个实验日所做所测量的点被清晰地分为1-5以及6-10两排。PCA图说明这10个点之间是存在差异的，但是相似系数计算分析不到它们之间的差异，见表Ⅲ。
　　这说明, 这些统计学方法无法告知我们这些差异有多大，更加无法知道它们差异到达何种程度才可以下结论说两个点（每个点代表一个指纹）之间存在了显著性的差异。我们分析广东和江西两地的川芎指纹时也出现同样的情况（图Ⅲb，Ⅲc）。

　　结论：
　　本文建立用液相HPLC方法建立了川芎指纹图谱，通过向量余弦、相关系数和主成分分析法，研究了三个产地的川芎样品间的差异。并探讨了在研究相似性方面这三个方法的不足。
　　从三个产地各自的PCA投影图中，我们看出在各产地内部的10个指纹间也存在差异，甚至可以把两个实验日所做的指纹区分开来（特别是四川和江西的投影图）。但是，无论是向量余弦法，相似系数法或PCA投影图分析，都难以为我们提供一个数据评价这些差异究竟有多大。
　　在这三个方法中，主成分分析（PCA）把指纹图谱与矢量相接合，并以降维手段把指纹图谱之间的异同直观地用图形表达出来，为中药指纹图谱的相似性研究提供了方向，但它难以应用到工业生产中。而向量余弦和相关系数给出的数字难以给出判断差异性存在的标准指标，也难以评价同一样品内部一致性。这些方法并不是建立中药指纹图谱方面的最有价值的方法，国家在中草药指纹图谱建设计划中急须建立一套有效的方法，科学地评价出指纹图谱间的差异。